婴幼儿奶粉中5种核苷酸分析报告
案例来源：博纳艾杰尔
核苷酸是生命遗传物质RNA的基本组成单位，是体内合成核酸的前身物。婴幼儿正处在快速生长发育阶段，身体对核苷酸的需求量超过体内合成核苷酸的能力，但母乳可为婴幼儿提供所需核苷酸。而对于没有母乳喂养的婴幼儿，食用含足量核苷酸的配方奶粉，不仅可提高免疫力，也可保护婴幼儿肠胃健康。
样品名称 | 中文同义名 | 英文简称 | 结构式 | 分子式 | 分子量 | CAS号 |
胞嘧啶核苷酸 | 胞苷酸 | CMP | 
| C9H14N3O8P | 323.2 | 63-37-6 |
次黄嘌呤核苷酸 | N/A | IMP | 
| C10H13N4O8P | 348.21 | 131-99-7 |
腺嘌呤核苷酸 | 腺苷酸 | AMP | 
| C10H14N5O7P | 347.22 | 61-19-8 |
尿嘧啶核苷酸 | 尿苷酸 | UMP | 
| C9H13N2O9P | 324.18 | 58-97-9 |
鸟嘌呤核苷酸 | 鸟苷酸 | GMP | 
| C10H14N5O8P | 363.22 | 85-32-5 |
实验部分
仪器、试剂与材料
主要仪器设备
高效液相色谱仪，紫外检测器；
试剂材料
屈臣氏水；甲醇为色谱纯；磷酸二氢钾色谱纯；磷酸、四丁基硫酸氢铵为分析纯；
胞嘧啶核苷酸（胞苷酸）、腺嘌呤核苷酸（腺苷酸）、尿嘧啶核苷酸（尿苷酸）、次黄嘌呤核苷酸、鸟嘌呤核苷酸（鸟苷酸）标准品；
高效液相色谱柱：Venusil ® C18 Plus；5μm，120Å，4.6×250mm
样品制备
5种核苷酸混合标准溶液：分别称取核苷酸标准品CMP、AMP、UMP各10mg、GMP、IMP各5mg(精确至0.1mg)，用水溶解成并定容至100mL，混匀，即得；
某品牌婴幼儿奶粉样品溶液：称取5.0g奶粉样品，用20mL热水(50~60℃)充分溶解试样，冷却至室温；用10%乙酸溶液调节pH至4.1，移至50mL容量瓶中，定容，滤纸过滤，所得滤液用0.45μm滤膜过滤，即得样品溶液。
色谱条件
色谱柱：
Venusil ® C18 Plus；5μm，120Å，4.6×250mm；
流动相：
称取1.360g磷酸二氢钾，加0.4753g四丁基硫酸氢铵至1000mL容量瓶中，用水补齐至刻度，准确加2.5ml磷酸和40mL甲醇，混匀后超声10min。（备注：由于流动相中含离子对试剂，色谱柱需要先用流动相平衡至少90min后，再运行4针标准品，系统才能稳定）
波长：254nm；
柱温：30℃；
流速：1.0mL/min；
进样量：10µL。
结果与讨论
本实验按照GB5413.40-2016婴幼儿食品和乳品中核苷酸的测定中方法，使用Venusil® C18 Plus色谱柱对5种核苷酸混合标准溶液、婴幼儿奶粉样品溶液进行检测，由以下结果可知，婴幼儿奶粉样品中五种核苷酸与杂质的分离度大于1.5，回收率97%~109%，满足实验需求。
表2.5种核苷酸实验数据
样品名称 | 化合物名称 | 保留时间/min | 理论塔板数 | 分离度 | 拖尾因子 | 备注 |
5种核苷酸混标 | CMP | 3.660 | 15803 | — | 0.98 | 图1 |
AMP | 5.608 | 16882 | 13.46 | 0.97 |
GMP | 11.061 | 18806 | 21.99 | 0.96 |
UMP | 21.226 | 21178 | 22.40 | 0.98 |
IMP | 26.011 | 20584 | 7.30 | 0.99 |
图1.Venusil ® C18 Plus色谱柱5种核苷酸混标高效液相色谱图
表3.某品牌婴幼儿奶粉5种核苷酸实验数据
化合物名称 | 保留时间/min | 分离度 | 拖尾因子 | 备注 |
CMP | 3.659 | — | 0.99 | 图2 |
杂质1 | 4.342 | 5.73 | - |
AMP | 5.605 | 8.48 | 0.94 |
杂质2 | 6.081 | 2.74 | - |
GMP | 11.051 | 18.91 | 0.97 |
杂质3 | 19.841 | 20.47 | - |
UMP | 21.223 | 2.57 | 0.95 |
IMP | 26.015 | 7.30 | 0.99 |
图2.Venusil® C18 Plus色谱柱婴幼儿奶粉样品溶液高效液相色谱图
表4.某品牌婴幼儿奶粉5种核苷酸加标实验结果
化合物名称 | 保留时间/min | 加标浓度（ug/mL） | 回收率（%） | 备注 |
CMP | 3.660 | 12.2 | 108.4 | 图3 |
AMP | 5.605 | 7.6 | 101.8 |
GMP | 11.050 | 9.2 | 97.7 |
UMP | 21.213 | 14.8 | 106.3 |
IMP | 26.028 | 11 | 101.9 |
图3.Venusil ®C18 Plus色谱柱婴幼儿奶粉样品加标溶液高效液相色谱图
结论
本实验按照GB5413.40-2016婴幼儿食品和乳品中核苷酸的测定中方法，使用Venusil® C18 Plus色谱柱对5种核苷酸混合标准溶液、婴幼儿奶粉样品溶液进行检测，结果表明在上述实验条件下，Venusil®C18 Plus色谱柱可用于婴幼儿奶粉中5种核苷酸的分析检测。
相关标准品
| 样品名称 | 化合物名称 | 保留时间/min | 理论塔板数 | 分离度 | 拖尾因子 | 备注 |
| 5种核苷酸混标 | CMP | 3.66 | 15803 | — | 0.98 | 图1 |
| AMP | 5.608 | 16882 | 13.46 | 0.97 |
| GMP | 11.061 | 18806 | 21.99 | 0.96 |
| UMP | 21.226 | 21178 | 22.4 | 0.98 |
| IMP | 26.011 | 20584 | 7.3 | 0.99 |
其他耗材
产品名称 | 订货号 | 规格描述 | 包装数量 |
Venusil ®C18 Plus | VPS952505-A | 5µm，120Å；4.6×250mm | 1支 |
1.5mL样品瓶 | 1109-0519 | 短螺纹透明带书写处 | 100/PK |
32×11.6mm |
1.5mL样品瓶盖 | 0915-1819 | 9mm中心孔蓝盖，红色橡胶/米色PTFE隔垫 | 100/PK |
45 ShoreÅ；1.0mm |
微孔滤膜 | AS021345-T | 单膜，13mm，0.45µm | 100个/包 |
一次性注射器 | LZSQ-2ML | 2mL无针头 | 100支/包 |
